Общая стратегия получения многоцветных флуорогенных пептидов для биоанализов без промывки

Флуоресцентная визуализация — незаменимый инструмент изучения биологических функций живых клеток, дающий молекулярную информацию с высоким пространственно-временным разрешением. Пептидные флуоресцентные зонды выделяются среди прочих структурной модульностью и специфичностью к мишени, однако большинство подходов к мечению пептидных последовательностей основаны на присоединении коммерческих флуорофоров к концевым группам или функционализированным боковым цепям. Такие стратегии дают зонды с ограниченным отношением сигнал/шум: либо требуются стадии промывки для удаления избытка лиганда, либо длительная инкубация для достаточного связывания и контраста. Альтернатива — флуорогенные красители, «включающиеся» при распознавании мишени; они позволяют визуализировать клетки без промывки, но рациональный дизайн включаемых пептидов сдерживается отсутствием стратегий создания многоцветных флуорогенных строительных блоков.

Флуорогенные аминокислоты (FgAAs) — универсальные строительные блоки для пептидных и белковых зондов для визуализации живых клеток. Существующие синтетические подходы обычно сводятся к присоединению готовых флуорогенов к аминокислотному остову через амидообразование, нуклеофильное замещение или кросс-сочетание. Однако готовые флуорогенные красители (например, дансил, нитробензодиазол, аминонафталимид и продан) обладают неоптимальными свойствами для клеточных экспериментов: короткими длинами волн возбуждения и эмиссии и ограниченной яркостью. Многоцветные FgAAs на новых структурах остаются малоизученными из-за отсутствия, во-первых, внутримолекулярных гасителей, применимых к разным флуоресцентным остовам, и, во-вторых, систематических инструментов предсказания механизмов флуорогенности.

За последнее десятилетие платформы скрининга лекарств направили значительные усилия на поиск малых молекул иммунотерапии, модулирующих функцию Т-клеток. Активность Т-клеток жёстко регулируется экспрессией рецепторов клеточной поверхности, в частности белка запрограммированной клеточной гибели 1 (PD-1) — рецептора иммунного контроля на поверхности активированных Т-клеток. Дисрегуляция экспрессии PD-1 напрямую связана с патологиями, уклоняющимися от иммунной системы (например, рак), или приводящими к аутоиммунным заболеваниям (ревматоидный артрит, рассеянный склероз). Разработка иммунотерапии выиграла бы от флуоресцентных скринингов, ускоряющих поиск фармакологических структур, нацеленных на путь PD-1.

В работе описана общая стратегия получения многоцветных FgAAs напрямую из ярких флуорофоров через единый механизм внутримолекулярного гашения триптофаном (Trp). Расчёты методами теории функционала плотности (DFT) и её временнóй версии (TD-DFT) показали, что Trp-индуцированное гашение определяется процессами, активируемыми локальным окружением: фотоиндуцированным переносом электрона (PeT) или скрученным внутримолекулярным переносом заряда (TICT). Стратегия позволила получить FgAAs, работающие от ультрафиолета до ближнего ИК, прямым присоединением Trp-гасителей к химически разнообразным йодированным флуорофорам. Кроме того, авторы показали, что FgAAs работают как высокоэффективные «включаемые» переключатели при твёрдофазном синтезе флуорогенных пептидов, визуализации клеток без промывки и флуоресцентном скрининге лекарств.

До сих пор синтез FgAAs ограничивался дериватизацией чувствительных к окружению каркасов аминокислотными фрагментами, что давало кодируемые аминокислоты (например, CouA, ANAP и дансилаланин) для получения рекомбинантных флуоресцентных белков, роторные флуорогенные d-аминокислоты на основе тетрагидрохинолина для визуализации транспептидазных реакций в бактериях или малые нитробензодиазолы для микроскопии сверхвысокого разрешения. Широкое применение таких аминокислот ограничено оптическими свойствами флуорогенных остовов: CouA, ANAP и дансилаланин имеют короткие длины волн возбуждения (<400 нм), перекрывающиеся с аутофлуоресценцией клеток, а тетрагидрохинолины и нитробензодиазолы — умеренные или низкие коэффициенты молярной экстинкции (в диапазоне 10^3–10^4 М⁻¹ см⁻¹).

Группа авторов и другие исследователи ранее показали тонкую настройку органических флуорофоров с помощью различных механизмов внутримолекулярного гашения: введение хелаторов ионов металлов (Cu2+, Sn2+) для ион-чувствительных красителей, спироциклизация для модуляции pH-чувствительности и мерцания, а также присоединение групп, индуцирующих безызлучательный перенос энергии и разделение зарядов (FRET, PeT, TICT). Во всех этих случаях степень флуорогенности оптимизируется индивидуально под конкретный флуорофор, и лишь немногие подходы широко применимы. В белках флуоресцентные метки могут гаситься соседними эндогенными остатками Trp при ван-дер-ваальсовом контакте; другие работы показывали гашение красителей при смешении с Trp или ковалентном присоединении к его алифатической аминогруппе. Опираясь на эти данные, авторы исследовали прямое внутримолекулярное гашение остовом Trp как универсальный синтетический способ получения FgAAs из конститутивно ярких флуорофоров.

Для проверки гипотезы была разработана сшивка аминокислоты Trp с несколькими йодированными флуорофорами через C–H-активацию. Методика позволила образовать C–C-связи между флуорофорами и положением 2 триптофана, давая компактные строительные блоки FgAAs с потенциально усиленным гашением за счёт коротких расстояний флуорофор–Trp. Сначала были получены шесть йодированных флуорофоров с разной химической структурой и спектральными профилями: кумарин, флуорон, BODIPY, оксазон, O-родамин и Si-родамин.

Маршруты синтеза йодированных предшественников различались. Кумарин 1 получили прямым йодированием коммерческого 7-диэтиламино-4-метилкумарина иодом с выходом 71%. BODIPY 2 синтезировали по однореакторной схеме кислотно-катализируемой конденсацией m-йодбензальдегида с двумя эквивалентами 2,4-диметилпиррола с последующим окислением DDQ и комплексообразованием с BF3 — общий выход 41%. Йодированный предшественник флуорона HPF 3 получили конденсацией 4-йодбензальдегида с резорцином в кислой среде; продукт выделили в хорошей чистоте, но с очень низким выходом — менее 10%. Для O-родамина (6) и Si-родамина (7) провели реакции обмена литий–галоген между 1,4-дийодбензолом и ксантоновыми предшественниками 4 и 5, оптимизировав условия избытком 1,4-дийодбензола и n-BuLi, чтобы минимизировать неийодированные побочные продукты; выходы составили 40% и 83% соответственно. Оксазон 9 получили комбинированным способом: йодирование резорцина с последующей кислотно-катализируемой конденсацией с N,N-диметил-p-нитрозоанилином — общий выход около 20%.

Затем все йодированные флуорофоры сшили с Fmoc-защищённым Trp в стандартных условиях Pd-катализируемой C(sp2)–H-активации (Pd(OAc)2, AgBF4, TFA), получив FgAAs 10–15 с выходами от 15% до 74% и чистотой более 95%. По мнению авторов, это подтверждает, что синтетическая стратегия в принципе применима к широкому кругу флуоресцентных структур — достаточно получить их арил-йодированные предшественники.

Далее авторы оценили спектральные свойства всех FgAAs (10–15) в сравнении с точными родительскими структурами: кумарин (16), BODIPY (17), HPF (18), O-родамин (19), оксазон (20) и Si-родамин (21). Все FgAAs показали низкие квантовые выходы флуоресценции — в среднем 1–2%, то есть как минимум на порядок ниже конститутивно ярких исходных флуорофоров, что подтвердило сильное внутримолекулярное гашение Trp в разных флуоресцентных структурах. У большинства FgAAs (соединения 11, 12, 13 и 15) прямая связь с Trp не влияла на профили поглощения и эмиссии. Напротив, кумариновая и оксазоновая аминокислоты (10 и 14) показали небольшие батохромные сдвиги максимумов поглощения и эмиссии (кумарин: 16 нм по возбуждению, 56 нм по эмиссии; оксазон: 28 нм и 10 нм) из-за расширения π-сопряжённых систем. Коэффициенты молярной экстинкции при этом в значительной степени сохранялись, достигая 10^5 М⁻¹ см⁻¹ у O-родамин- и Si-родамин-производных.

Вычислительный анализ (DFT/TD-DFT) показал, что механизм гашения — PeT или TICT — зависит от локального окружения: PeT облегчён в полярных средах. Ключевым параметром оказался энергетический зазор между HOMO флуорофора и HOMO-1 (локализованной на триптофане): например, у Si-родамин-AA он составил 0.146 эВ, у BODIPY-AA −0.091 эВ, у HPF-AA −0.280 эВ, а у O-родамин-AA — всего 0.013 эВ, что и обеспечивает эффективный PeT-перенос.

Авторы интегрировали FgAAs в твёрдофазный синтез пептидов (SPPS), получив «включаемые» зонды для микроскопии живых клеток в реальном времени без стадий промывки. Флуорогенные пептиды демонстрировали высокое отношение сигнал/шум при связывании с мишенями на поверхности клеток.

На этой основе были спроектированы флуорогенные пептиды, нацеленные на PD-1. Их оценка на активированных Т-клетках человека показала, что зонды позволяют отслеживать экспрессию и активность рецептора и проводить флуоресцентный скрининг соединений.

С помощью флуорогенного пептида 36 группа провела скрининг малых молекул на активированных Т-клетках и идентифицировала авасимиб как модулятор экспрессии PD-1. Механизм действия авасимиба на экспрессию PD-1 в работе не раскрыт.

По заключению авторов, работа устанавливает рациональную стратегию дизайна многоцветных FgAAs для пептидной инженерии, визуализации и поиска лекарств. Химический подход позволяет использовать оптические и физико-химические свойства ярких флуорофоров для их встраивания в пептиды и белки в исследованиях таргетной биовизуализации в реальном времени.