Универсальная стратегия функционализации олигонуклеотидов через фосфитилирование на носителе

Олигонуклеотиды применяют в молекулярной биологии, секвенировании, диагностике и терапии: они позволяют управлять экспрессией генов и молекулярным распознаванием. Химические модификации — внутри цепи и на концах — повышают стабильность, настраивают гибридизацию и вводят функциональные группы для конъюгации меток, гаптенов и агентов доставки. Это важно и для молекулярной биологии, и для терапии на основе антисмысловых олигонуклеотидов и малых интерферирующих РНК (siRNA).

Более четырёх десятилетий стандартом синтеза олигонуклеотидов остаётся фосфорамидитная химия. Цикл включает четыре стадии: каплинг 5′-гидроксила растущей цепи с 3′-фосфорамидитным мономером; capping непрореагировавших 5′-гидроксильных групп; окисление фосфита до фосфотриэфира; снятие 5′-тритильной защиты для продолжения синтеза либо глобальное депротектирование и отщепление от носителя.

Фосфорамидитные блоки нестабильны, требуют хранения при низких температурах в инертной атмосфере и даже в этих условиях постепенно деградируют автокаталитически и гидролитически. Мономеры для улучшения клеточного захвата и таргетинга дороги и ограничены в ассортименте, а избыток реагента для доведения каплинга трудно рекуперировать. Постсинтетические модификации — амидирование через активированные эфиры, CuAAC и другие click-конъюгации — обычно требуют дополнительных стадий: манипуляций с защитными группами и связанных очисток.

Авторы предложили стратегию, в которой доступные, дешёвые и устойчивые к воздуху и влаге спирты, включая нуклеозиды, напрямую функционализируют растущую олигонуклеотидную цепь. Такой подход допускает сайт-специфические терминальные и внутренние модификации и упрощает рекуперацию непрореагировавших спиртов и нуклеозидных мономеров.

Ключ к подходу — прямое фосфитилирование 5′-гидроксильной группы растущей иммобилизованной цепи с последующим in situ каплингом активированного 5′-P(III)-конца с гидроксилом нуклеофильного модификатора либо, для наращивания цепи, с 3′-гидроксилом растворимого 5′-DMT-защищённого (DMT — диметокситритил) нуклеозида.

У стратегии несколько преимуществ. Во-первых, 5′-DMT-защищённые нуклеозиды и другие спирты-нуклеофилы — стабильные, доступные и недорогие альтернативы чувствительным 3′-фосфорамидитам. Во-вторых, исключена нежелательная активация на смоле вновь введённого DMT-защищённого нуклеозида, которая иначе ведёт к примесям (n+1). В-третьих, непрореагировавший 5′-фосфорамидит при окислении превращается в неактивный 5′-фосфат, что устраняет необходимость в отдельной стадии capping.

Подход агностичен к направлению синтеза: он совместим и со стандартным направлением 3′→5′, и с обратным 5′→3′, что даёт доступ к олигонуклеотидам с широким набором функциональных групп на 5′- или 3′-конце.

Существующий подход на основе фосфорамидитных мономеров плохо переносит ряд функциональных групп. Азидную группу, удобную для биоконъюгации по алкину, трудно ввести из-за несовместимости азидов с P(III)-реагентами; свободные аминогруппы обычно требуют защиты на время синтеза. Стратегия авторов обходит эти ограничения: нуклеофильная атака первичного спирта на фосфорамидит превалирует над побочными реакциями с азидом или свободным амином. Эта хемоселективность устраняет необходимость в защитных группах.

Реализацию начали с модельных олигонуклеотидов B(dT)9, иммобилизованных на 3′-CPG (контролируемое пористое стекло), где B — A (1a), T (1b), G (1c) и C (1d), с нагрузкой 25–30 µmol g−1. После снятия 5′-концевой DMT-защиты свободный 5′-гидроксил фосфитилировали 3-((бис(диизопропиламино)фосфино)окси)пропаннитрилом ([P–N]) с активатором 5-бензилтио-1H-тетразолом (BTT), получая фосфорамидиты 2a–2d. In situ каплинг с декан-1-олом давал фосфит-триэфиры 3a–3d, которые окисляли йодом и подвергали глобальному депротектированию; свободные олигонуклеотиды 4a–4d получались с конверсией 86–90%.

Затем оптимизированные условия применили к высоконагруженному олигонуклеотиду смешанной последовательности 1e с 2′-F- и 2′-O-Me-замещёнными нуклеотидами на полистирольном носителе (350 µmol g−1). Каплинг проводили с рядом спиртов; окисление и сульфурирование — йодом, (1S)-(+)-(10-камфорсульфонил)-оксазиридином (CSO) или 3-этокси-1,2,4-дитиазолидин-5-оном (EDITH).

Каплинг фосфорамидита 2e с декан-1-олом или гептан-1-олом давал 4e, 4f и 4f′ с конверсией 90–92%. Липидные спирты — 1-тетрадеканол, гексадекан-1-ол и cis-9-октадецен-1-ол — вводились с конверсией 81–90% (4g–4i). Липофильный «хвост», как показано ранее, усиливает мембранную аффинность, клеточный захват и биостабильность олигонуклеотидов.

Далее авторы вводили нуклеофилы с дополнительными функциональными группами: алкиновые, алкеновые и азидные боковые цепи обеспечивают селективные click-сшивки, а амины и тиолы — ортогональные пути конъюгации с флуорофорами и пептидами. Алкиниловые и алкениловые спирты каплировались с конверсией 88–94% (4j–4n); реакция с 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этан-1-олом давала азидо-олигонуклеотид 4o с конверсией 74%, при этом Staudinger-подобного восстановления азида P(III)-центром не наблюдалось.

Благодаря оксофильности промежуточного фосфорамидита удалось провести хемоселективные функционализации бифункциональными нуклеофилами. 3-(Диметиламино)пропан-1-ол и 6-аминогексан-1-ол реагировали селективно по гидроксилу с конверсией 71–90% (4p, 4q), давая 5′-аминомеченые олигонуклеотиды.

Депротектированный олигонуклеотид мечали N-гидроксисукцинимидными эфирами BODIPY-FL и сульфоцианина 3 с почти количественной конверсией. Флуоресцентный олигонуклеотид также получали напрямую каплингом с красителем Cy3, несущим боковую цепь с первичным спиртом (4r).

6-Меркаптогексан-1-ол хемоселективно реагировал по гидроксильной группе, однако конкурировали образование дисульфидного димера олигонуклеотида и thia-Michael-аддукта акрилонитрила, возникающего при депротектировании фосфодиэфиров (4s). Чтобы подавить эти пути, авторы использовали 6,6′-дисульфанедиилбис(гексан-1-ол): он давал только целевой монозамещённый продукт и дисульфид-связанный бис-олигонуклеотид. Обработка смеси tris(2-карбоксиэтил)фосфином гидрохлоридом (TCEP) давала свободный тиол 4t с суммарной конверсией 85%; 5′-тиол-модифицированные олигонуклеотиды обычно хранят в виде дисульфидов, высвобождая тиол перед использованием.

Гексаэтиленгликоль давал моно- и дифункционализированные продукты в соотношении 3:2 (4u), действуя как «степлер» олигонуклеотидов. Концентрация спирта влияла на баланс каплинга и димеризации: в диапазоне 0,25–3,0 M оптимальной оказалась 0,25 M. Повышение концентрации спирта подавляло димеризацию, но слегка снижало эффективность каплинга.

Методология сочетает высокую эффективность каплинга, переносимость азидов, аминов и тиолов и рекуперацию избытка спиртов и мономеров. Авторы рассматривают её как платформу для диверсификации терапевтических модификаций олигонуклеотидов.